《Nature質譜技術與結構生物學解釋脂多糖-蛋白質複合物結構與作用》
撰文|鹿明生物脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）存在於革蘭氏陰性菌的外膜（outer membrane），起到細胞屏障的作用。LPS在臨床上可以引起敗血性休克（septic shock）進而導致死亡，LPS的脂A內核（Lipid A core）是多粘菌素抗生素（polymyxin antibiotics）的靶點。盡管多粘菌素在臨床上均有重要性，並且已經有多種耐藥菌株出現，但是目前對LPS生物合成的調節機制仍然不清楚。近日，來自Genentech公司的科學家們在Nature發表了論文，對存在革蘭氏陰性菌內膜（inner membrane）上的蛋白質PbgA進行了詳細表征，並指出其可以通過降低LPS的含量以及外膜的完整性來降低大腸杆菌（Escherichia coli）的毒性。該課題組首先通過結構生物學和代謝組學研究鑒定出革蘭氏陰性菌內膜上存在一個脂A的結合區域（lipid A-binding motif），隨後發現PbgA衍生多肽可以選擇性的與LPS結合，進而抑制革蘭氏陰性菌的生長（其中包括對多粘菌素具有抗藥性的菌株）。通過進一步的蛋白質組學、代謝組學、遺傳學和藥理學實驗，作者建立了一個PbgA調控LPS的模型。這是首次報道PbgA具有調控LPS的作用，為後續新抗生素的發現提供的新的機會。
PbgA是一種內膜蛋白質，推測其功能是攜帶心磷脂（cardiolipin）並將其從細胞內膜運輸到細胞外膜。然而最近的結構研究未能證實該功能。作者選擇研究PbgA，是因為PbgA涉及到沙門氏菌（Salmonella，屬於大腸杆菌）的發病機理，其在維持外膜中的作用依然未知。作者首先對一株PbgA缺失的菌株（Δ pgbA）進行了研究，相關指標（包括回收的菌落形成單位（CFU），對血清、利福平的敏感性、細胞形態等）顯示，與野生菌株相比，PbgA缺失的菌株表現出細胞形狀的喪失和膜破裂；總脂質A（total lipid A）減少等，這些均顯示脂質穩態的喪失，證實了PbgA在維持外膜功能中的重要性。有意思的是，一株PgbA缺失的菌株，在缺乏心磷脂的環境下，並沒有表現出對利福平的敏感性，促使作者進一步的研究PgbA在心磷脂缺乏環境下的發病機理。為了深入研究PgbA的功能，作者對純化後的PgbA利用X射線衍射進行分析。結果顯示其周質結構域（periplasmic domain）錨定在跨膜結構域（transmembrane domain，TMD）上，在內膜上方形成了一個60的突出區域。通常能轉運心磷脂的區域大約在200左右，因此PgbA在結構上不具備轉運心磷脂的條件；此外，將PgbA的結構與EptA linker(已確定具有心磷脂轉運功能)相比，兩者的結構並不完全相似。（圖1）。
圖1 | PbgA結構特征為了證實PgbA無法轉運心磷脂以及PgbA哪些化合物結合，作者采用了結構模擬計算和基於質譜的代謝組學的方法。結構模擬實驗中，加入心磷脂後的模型無法形成穩定的電子密度；代謝組學實驗則利用質譜對純化後的PgbA進行分析，並沒有鑒定到心磷脂。但是在代謝數據中，發現了多種脂質A（lipid A）的存在（圖2）。隨後作者利用脂質A與PbgA進行結構模擬，發現在脂質A存在的情況下，PgbA的結構模型趨向合理，由此推測PgbA可以與脂質A結合，進而與LPS分子結合。進一步的實驗證明當PgbA與脂質A的結合區域發生突變時，細胞外膜功能會喪失，表明了LPS-PbgA結合是維持外膜穩態的重要因素。
圖2 | LPS共純化物中鑒定出脂質A鑒於PbgA可以與LPS結合，作者推測利用PbgA結合區域的保守序列所衍生出的多肽，在體外也可以與LPS結合。實驗顯示一種衍生肽（LABWT+ ）對LPS具有更強的親和力，並且對磷脂依然保持有選擇性。由於多粘菌類抗生素是通過靶向脂質A來抑制革蘭氏陰性菌，作者提出可以優化衍生肽的序列，從而使其具有廣譜活性，有利於後續藥理學領域的開發。為了揭示PbgA與LPS結合的生理作用，作用使用免疫共沉澱-質譜技術對內源性大腸杆菌的PbgA進行了蛋白質組分析，結果共鑒定出2個細胞被膜（cell envelope）蛋白：PlsY和LapB。在完整的大腸杆菌中，這兩個蛋白質與PbgA相互作用，其中PlsY參與了磷脂合成，LapB參與LPS的生物合成。與PbgA的功能類似，LapB的存在對外膜的功能也是必須的，LapB通過與一種蛋白酶FtSH (FtSH protease) 相互作用來 促進LpxC（一種在脂質A生物合成過程中起關鍵性作用的蛋白酶）的降解；而免疫共沉澱數據發現PbgA與FtSH沒有相互作用，但實驗表明在PbgA耗盡後未檢測到LpxC；而當PbgA過表達時LpxC水平則升高。結合PbgA獨特的空間位置，作者推測PbgA通過直接感知LPS，進而通過LapB-LpxC機制來維持外膜的穩態。作者最後指出，一系列的實驗和結構模擬提示PbgA的結構與已知的轉運蛋白結構不相似，並且心磷脂無法與PbgA共純化，可以推斷心磷脂無法之前推測的那樣與PbgA結合。而通過代謝組學發現的脂質A，則為PbgA的選擇性脂質識別提供了一個新的範例。利用這種選擇性識別衍生出的LPS結合肽，顯示出對病理性的大腸杆菌等革蘭氏陰性菌的殺傷能力，為相關藥理學研究提供了新的思路。小鹿貼士作者首先通過結構生物學的模型推測PbgA無法與心磷脂結合，進而通過基於質譜的代謝組學技術篩選出與PbgA結合的化合物（脂質A）；通過免疫共沉澱的蛋白質組學方法鑒定出與PbgA相互作用的蛋白質，進而揭示了PbgA與LPS複合物的作用機理。質譜技術由於其通用性，可以進行非靶向性的分析，例如文本中利用代謝組學，發現PbgA的共純化中不含有心磷脂，含有脂質A。也可以結合免疫共沉澱結技術進行靶向分析，例如文本利用對應的抗體，鑒定出於PbgA結合的蛋白質。在結構生物學研究中，質譜技術可以與電鏡技術、理論模擬相結合，提供更全面的解決方案。參考文獻：1.T. Clairfeuille et al., Structure of the essential inner membrane lipopolysaccharide–PbgA complex. Nature 584, 479-483 (2020).猜你還想看◆科研前沿 | 張宏、張明傑、朱學良、李丕龍等多位專家聯合撰寫“生物學中的液-液相分離：機制、功能和疾病”長篇綜述◆Nature | 關注!斯坦福大學通過靶向溶酶體的嵌合體可用於降解細胞外蛋白◆【高分】Nature |清華大學李海濤組聯合揭示組蛋白H3.3可增強刺激誘導型轉錄◆Science | 經典重要科學問題：蛋白質三維結構預測與優化END文章來源於鹿明生物
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