朗讀酵母文庫及蛋白質組學助力鹿明生物合作客戶喜登NC(IF:12.121)第酵母文庫及蛋白質組學助力鹿明生物合作客戶喜登NC(IF:12.121)

《酵母文庫及蛋白質組學助力鹿明生物合作客戶喜登NC(IF:12.121)》
鹿明生物中文標題：tRNA硫醇化途徑關鍵基因SLG1在水稻抵抗高溫脅迫中的機制研究研究對象：水稻發表期刊：Nature Communications影響因子：12.121發表時間：2020年10月30日合作單位：中國科學院遺傳與發育生物學研究所植物基因組學國家重點實驗室運用歐易/鹿明生物技術：iTRAQ蛋白質組學(由鹿明生物提供技術支持)、酵母文庫研究背景近些年，全球氣候變暖所造成的高溫脅迫持續影響著水稻的產量和品質，挖掘水稻耐高溫基因，對於改良水稻品種耐熱性至關重要。另一方面，傳統的秈粳稻由於起源地和種植範圍的差異，對於溫度的適應性也有很大差別，秈稻種植在溫度較高的地區，一般對高溫有更強的抵抗能力，但其中的遺傳基礎尚不清楚。tRNA硫醇化(mcm5s2U34) 是一種重要的tRNA轉錄後修飾形式，在酵母、線蟲、人類中的研究表明，tRNA硫醇化對於維持生物體正常發育和代謝、響應環境脅迫尤其是熱脅迫等方面發揮著重要作用。然而，植物中tRNA硫醇化在高溫脅迫響應中的功能仍然未知。研究結果1、 SLG1在水稻耐熱性中發揮正調控作用通過篩選以KY131（溫帶粳稻，Tej）為背景的NaN3誘變M2文庫，鑒定出了具有細長植物結構和增加了粒長的突變體slg1（圖1a，b）。在slg1和KD8（溫帶粳稻）的F2群體中，候選基因座直接定位到12號染色體的標記C1和C5之間（圖1c）。對834個具有突變表型的F2個體進一步分析，將目標基因縮小到了標記C4和C6之間的310 kb區域內（圖1c）。序列比較表明，突變體中LOC_Os12g39840的第5個內含子的剪接受體位點存在突變位點（從G到A）（圖1c），導致錯剪和形成多個轉錄本。所有21個獨立的T2轉基因品系（slg1-C）均顯示出與WT類似的總體表型，包括粒長和植物結構（圖1a，b）。SLG1-RNAi轉基因植物表現出與slg1相似的表型（圖1a，b），證實LOC_Os12g39840確實是slg1突變體的致病基因。SLG1編碼一個保守的細胞質tRNA 2-硫化蛋白2（RCTU2），它的功能缺陷會導致水稻體內的tRNA硫醇化水平缺陷，並伴隨明顯的高溫敏感表型；而過表達SLG1則可顯著提高水稻對高溫耐受性。slg1是高度熱敏性的，約45％的突變幼苗在45°C處理44 h後死亡，而恢複後90％以上的WT存活（圖1e）；同樣，高溫處理後SLG1-RNAi植物的存活率也顯著降低（圖1f和圖1f）。相反，在相同的脅迫條件下，SLG1-OE幼苗的存活率（> 90％）比野生型（≈60％）要高得多（圖1g），SLG1-OE粒長和植物構型與野生型相似（圖1a，b）。綜上所述，這些結果表明SLG1在水稻耐熱性中發揮正調控作用。在酵母中，CTU2似乎通過與CTU1形成功能複合物而催化tRNA硫醇化過程的最後一步。在水稻中鑒定出LOC_Os02g52470和LOC_Os01g41565的兩種同源蛋白。LOC_Os02g52470與ROL5 / AtCTU1具有很高的序列相似性，因此標注為水稻CTU1蛋白（RCTU1）。為了研究RCTU1是否與SLG1在相同的作用途徑，分別在WT（SLG1RCTU1-RNAi）和slg1（slg1RCTU1-RNAi）背景下構建了RCTU1-RNAi轉基因植物，發現SLG1RCTU1-RNAi和slg1RCTU1-RNAi轉基因植物均表現出與slg1類似的表型，包括增加的籽粒長度，細長的植物結構和有缺陷的根系。此外，類似於SLG1，RCTU1的轉錄也被高溫高度誘導（圖1d），並且SLG1RCTU1-RNAi和slg1RCTU1-RNAi幼苗的存活率在高溫下均大大降低（圖1h）。這些結果表明，RCTU1-SLG1複合物在水稻耐熱性中起重要作用。
圖1 | SLG1在水稻耐熱性中發揮正調控作用（a，b） slg1，WT和slg1-C，SLG1-RNAi和SLG1-OE的T2轉基因植株表型和粒形；（c）SLG1基因的精細定位；（d）SLG1和RCTU1在高溫誘導下的表達；（e–g） SLG1是耐熱性的正調控因子；（h） RCTU1-RNAi顯示出與slg1突變體相似的表型；2、SLG1介導的耐熱性與硫醇化tRNA水平呈正相關CTU1–CTU2複合物負責胞質tRNA的2-硫醇化，硫醇化的損失導致了酵母菌株中的熱敏表型的喪失。本研究發現slg1中的硫醇化tRNA數量遠低於WT，這表明SLG1的功能喪失會破壞突變體中的tRNA硫醇化。SLG1的功能異常會影響tKUUU，tEUUC和tQUUG的硫醇化水平（圖2b）。通過比較正常和高溫條件下的硫醇化tRNA水平來分析高溫對tRNA硫醇化的影響。升溫影響水稻中U34的硫醇化並導致tRNA的低硫醇化（圖2c）。在高溫下，WT中的tRNA硫醇化水平比slg1高得多（圖2d），這與WT的較高存活率相符（圖1e）。隨著WT，SLG1RCTU1 RNAi，slg1和slg1RCTU1-RNAi中tRNA硫醇化水平的降低（圖2e），植物的存活率分別降低至90％，36.5％，15.2％和5％（圖2e）。相反，與WT相比，具有更高tRNA硫醇化水平的SLG1-OE植物具有更高的耐熱性（圖1g，2f）。綜上所述，SLG1介導的耐熱性與tRNA硫醇化水平呈正相關。
圖2 | SLG1介導的耐熱性與tRNA硫醇化水平呈正相關（a）slg1和WT之間tRNA硫醇化水平的比較；（b） Northern印跡分析，使用tKUUU，tEUUC和tQUUG的3種tRNA異構體來檢測特異的硫醇化tRNA；（c） tRNA硫醇化過程受到高溫脅迫的不利影響。NC，正常情況；HC，高溫（45°C，44 h; g）條件下。（d–f） tRNA硫醇化水平的比較；此外，本文運用iTRAQ蛋白質組學探索了tRNA硫醇化對蛋白質的影響，鑒定到1610個蛋白，其中112個為差異蛋白（FC1.2）。發現SLG1的功能障礙會影響蛋白質的積累，尤其是涉及翻譯，代謝和應激反應的蛋白質的積累。蛋白質組學分析也揭示了slg1突變體中五種蛋白質（TrEMBL UniProt ID：Q6ZFJ9，Q651B0，Q653F6，Q6Z2M2和Q9LWT6）的積累，這些蛋白質與unfolded protein binding and chaperone-mediated protein folding有關。此外，發現該突變體中異常合成了一些氧化應激相關蛋白，例如TrEMBL UniProt ID Q0E4K1，Q0DTX5，P93407和Q6L4W7，這可能是由於未折疊的蛋白應答與活性氧（ROS）信號。因此，植物中的tRNA硫醇化狀態似乎與ROS穩態密切相關，這可能對攜帶SLG1Ind的植物耐受高溫脅迫有利。3. SLG1的分化分析使用4219個水稻種質進一步分析了SLG1的自然變異，並在SLG1的啟動子和編碼區分別發現了10個和7個SNP（圖3a）。在編碼區的七個SNP中，T865C和G1839T的兩個核苷酸取代分別引起氨基酸從Val177到Ala177的轉化以及從Val362到Phe362的氨基酸轉化，而其他五個是同義取代（圖3a）。在栽培稻中發現了兩個氨基酸突變，其中9稻中有Val8.2-Val362的9稻占98.2％，粳稻中Ala177-Phe362的粳稻占99.1％，表明它們對SLG1的功能分化有貢獻。基於多態性，可將4219個種質分為5個單倍型（圖3b），其中767個（96.1％）溫帶粳稻種中的737攜帶Hap1，而2691個（93.9％）in稻種中的2527個攜帶Hap2。值得注意的是，幾乎所有的aus種質（98.9％）都可以明確地分類為Hap4。熱帶粳稻（Trj）組有兩個主要的單倍型，Hap3（73.9％）和Hap1（25.5％），它們在啟動子區域中只有一個核苷酸（A252C）不同。Hap5僅在the蟲組中以極低的頻率（約0.8％）發現，與Hap2高度相似，除了啟動子區域的單個核苷酸差異（G432A）。除了野生稻種之間SLG1基因組區域的大量變異外，野生稻種中SLG1單倍型的數量與Ind，Tej，Trj和Aus的完全相同。例如，in稻品種93-11的SLG1等位基因與野生稻登錄號W1687（Hap2）相同；澳洲品種Kasalath與W593（Hap4）具有相同的單倍型；溫帶粳稻品種Nipponbare攜帶與W3078（Hap1）相同的SLG1等位基因，而熱帶粳稻品種NERICA3與W120（Hap3）具有相同的等位基因。這些結果表明，SLG1Tej，SLG1Trj，SLG1Ind和SLG1Aus可能代表了保存在不同麥冬野生稻種中的古老等位基因，並且可能在水稻馴化的早期進行了陽性選擇。
圖3 | SLG1在亞洲栽培稻中的分化（a）對來自4219個亞洲栽培稻種的SLG1啟動子和編碼區的單倍型分析；（b）五種SLG1單倍型在亞洲不同栽培稻品種中的分布頻率。4. SLG1Ind表現出很強的耐熱性推測SLG1差異可能是兩個亞種（indica和japonica）耐受不同環境溫度的決定性因素。通過將SLG1（SLG1Ind）的等位基因引入KY131（SLG1Tej）來構建近等基因系（NIL）（圖4a）。在正常生長條件下，獲得的NIL-SLG1Ind和NIL-SLG1Tej植物在苗期表現出與其相應受體相同的外觀（圖4b）。當遇到高溫脅迫時，NILSLG1Tej幼苗的存活率（50％）要比indica受體ZF802的存活率（93％）低得多（圖4b）。相反，NIL-SLG1Ind幼苗的耐熱性相對於KY131顯著提高，NIL-SLG1Ind的平均成活率約為81％，而KY131的平均成活率約為48％（圖4b），表明SLG1Ind優於SLG1Tej在植物中耐受高溫脅迫。
圖4 |  SLG1Ind比SLG1Tej具有更高的耐熱性（a）NIL-SLG1Ind和NIL-SLG1Tej的染色體圖。紅色矩形表示包含SLG1基因座的供體片段。NIL-SLG1Ind表示帶有來自ZF802（indica）的SLG1Ind等位基因的KY131（溫帶粳稻），NIL-SLG1Tej表示帶有來自KY131的SLG1Tej等位基因的ZF802；（b）SLG1Ind和SLG1Tej等位基因之間的耐熱性比較；為了進一步評估SLG1Ind和SLG1Tej之間的功能差異，通過轉基因方法擴增了KY131和93-11中SLG1的啟動子和基因序列，並將它們引入slg1中以生成互補植物JPJC（帶有Tej-的Tej型啟動子）。IPIC（具有Ind型基因序列的Ind型啟動子）品系顯示出比JPJC更高的耐熱性，在IPIC中的平均存活率約為69％，而在JPJC中約為29％（圖5a，b）。為了了解tRNA硫醇化在SLG1Ind和SLG1Tej的耐熱性差異中的作用，對IPIC和JPJC植物中的硫醇化tRNA進行了定量分析。slg1中的tRNA硫醇化水平比野生型顯著降低（圖5c），並且SLG1Ind或SLG1Tej的引入挽救了突變體的硫醇化缺陷（圖5c）。這些結果表明SLG1介導的tRNA硫醇化是SLG1Ind和SLG1Tej之間耐熱性差異的原因。
圖5 | SLG1Ind互補植物顯示出很強的耐熱性和高tRNA硫醇化水平（a，b） IPIC，IPJC，JPIC和JPJC之間的耐熱性比較；（c，d）基於LC/MS-QQQ（c）和APM（d）方法檢測slg1，WT，IPIC和JPJC轉基因品系中的tRNA硫醇化水平；5. SLG1Ind可提高水稻孕穗期的耐熱性水稻植物對高溫脅迫高度敏感，尤其是在孕穗期，因此提高生殖階段的耐熱性對於減少產量損失尤為重要。對成年植物slg1和WT進行了高溫處理，以評估SLG1在孕穗期的作用。發現slg1的結實率低於28％，而WT的結實率在40°C處理5天後可達到72％（圖6a，b）。這些結果表明，SLG1在生殖階段的耐熱性中起重要作用。在我們的NIL品系中，我們觀察到NILSLG1Ind植物的育性降低，這很可能是由於SLG1與雜種不育基因HSA145的緊密聯系所致。為了進一步探討SLG1在生殖階段的可能作用，我們從IPIC，IPJC，JPIC和JPJC構建體中分別選擇了8條獨立系，其中一半經高溫處理5天，另一半經7天處理。IPIC顯示出最高的結實率，在高溫處理5天和7天後分別達到約81％和49％（圖6c，d）；相反，JPJC的結實率分別僅為約47％和22％（圖6c，d）。處理5天和7天後IPJC系的結實率分別約為68％和43％，而JPIC系的結實率分別約為63％和37％（圖6c，d）。這些結果進一步表明，SLG1Ind的啟動子和編碼序列上的變異都有助於水稻的耐熱性。
圖6 | SLG1Ind可以提高孕穗期的耐熱性（a，b）slg1突變體在孕穗期對高溫高度敏感；（c，d） IPIC，IPJC，JPIC和JPJC之間的耐熱性比較；研究結論SLG1編碼一個保守的細胞質tRNA 2-硫化蛋白2 (RCTU2)，它的功能缺陷會導致水稻體內的tRNA硫醇化水平缺陷，伴隨著明顯的高溫敏感表型；而過表達SLG1則能夠顯著提高水稻對高溫耐受性。通過對栽培稻序列分析發現，SLG1在品種中存在單倍型分化，其中96.1%的溫帶粳稻屬於一種單倍型，而93.9%的秈稻則屬於另外一種單倍型，暗示SLG1可能是一秈粳稻分化基因，核酸序列多態性分析也表明SLG1是一個顯著的馴化選擇位點。攜帶秈型SLG1的水稻植株對孕穗期高溫也具有更強的抵抗能力。
圖7 | 馴化期間SLG1等位基因的選擇模型小鹿推薦SLG1能夠與水稻中細胞質tRNA 2-硫化蛋白1（RCTU1）互作，RCTU1功能缺陷也導致水稻tRNA硫醇化水平降低和高溫敏感表型。水稻的高溫耐受性和tRNA硫醇化水平呈正相關。通過對4219個栽培稻序列分析發現，SLG1在品種中存在單倍型分化，其中96.1%的溫帶粳稻屬於一種單倍型，而93.9%的秈稻屬於另一種單倍型，暗示SLG1可能是一秈粳稻分化基因，核酸序列多態性分析也表明SLG1是一個顯著的馴化選擇位點。通過對近等基因系及轉基因植株的高溫處理試驗表明，攜帶秈型SLG1的水稻植株比攜帶粳型SLG1水稻植株具有更強的高溫耐受能力，且與tRNA硫醇化水平呈正相關。通過啟動子和編碼區互換不同轉基因材料熱處理實驗顯示，SLG1啟動子區和編碼區的序列差異共同決定秈型和粳型SLG1耐熱性差異。同時，攜帶秈型SLG1的水稻植株對孕穗期高溫也有更強的抵抗能力。因此，該研究證明tRNA硫醇化修飾在水稻響應高溫脅迫中的重要功能，並為應對全球變暖、設計培育高溫脅迫耐受性水稻品種提供有效策略。鹿明生物專業做蛋白組學、代謝組學得組學研究，本文章酵母文庫及蛋白組學為鹿明生物合作客戶文章，詳情請訪問鹿明生物官網參考文獻：Xu Y, Zhang L, Ou S, Wang R, Wang Y, Chu C, Yao S. Natural variations of SLG1 confer high-temperature tolerance in indica rice. Nat Commun. 2020 Oct 28;11(1):5441. doi: 10.1038/s41467-020-19320-9. PMID: 33116138.猜你還想看◆看看專家們怎麼做研究？2020質譜組學研討會-腫瘤機制解析與分型診斷◆恭喜 | 10月，歐易/鹿明生物蛋白/代謝方向13家合作課題組老師順利發文◆涅槃重生｜植物蠟質開啟新征程—新品2.0版全新上線！！！◆項目文章 JCC | LC-MS非靶代謝組學助力南京大學朱維銘、李毅團隊喜登IF=8.658醫學頂刊◆新品 | 2大尚方寶劍，雙平台+雙自建數據庫助力醫學代謝組學研究END文章來源於鹿明生物
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