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鹿明生物

中文標題：
tRNA硫醇化途徑關鍵基因SLG1在水稻抵抗高溫脅迫中的機制研究

研究對象：
水稻

發表期刊：
Nature Communications

影響因子：
12.121

發表時間：
2020年10月30日

合作單位：
中國科學院遺傳與發育生物學研究所植物基因組學國家重點實驗室

運用歐易/鹿明生物技術：
iTRAQ蛋白質組學(由鹿明生物提供技術支持
)、酵母文庫

研究背景

近些年，全球氣候變暖所造成的高溫脅迫持續影響著水稻的產量和品質，挖掘水稻耐高溫基因，對於改良水稻品種耐熱性至關重要。另一方面，傳統的秈粳稻由於起源地和種植範圍的差異，對於溫度的適應性也有很大差別，秈稻種植在溫度較高的地區，一般對高溫有更強的抵抗能力，但其中的遺傳基礎尚不清楚。tRNA硫醇化(mcm5s2U34) 是一種重要的tRNA轉錄後修飾形式，在酵母、線蟲、人類中的研究表明，tRNA硫醇化對於維持生物體正常發育和代謝、響應環境脅迫尤其是熱脅迫等方面發揮著重要作用。然而，植物中tRNA硫醇化在高溫脅迫響應中的功能仍然未知。

研究結果

1、 SLG1在水稻耐熱性中發揮正調控作用

通過篩選以KY131（溫帶粳稻，Tej）為背景的NaN3誘變M2文庫，鑒定出了具有細長植物結構和增加了粒長的突變體slg1（圖1a，b）。在slg1和KD8（溫帶粳稻）的F2群體中，候選基因座直接定位到12號染色體的標記C1和C5之間（圖1c）。對834個具有突變表型的F2個體進一步分析，將目標基因縮小到了標記C4和C6之間的310 kb區域內（圖1c）。序列比較表明，突變體中LOC_Os12g39840的第5個內含子的剪接受體位點存在突變位點（從G到A）（圖1c），導致錯剪和形成多個轉錄本。所有21個獨立的T2轉基因品系（slg1-C）均顯示出與WT類似的總體表型，包括粒長和植物結構（圖1a，b）。SLG1-RNAi轉基因植物表現出與slg1相似的表型（圖1a，b），證實LOC_Os12g39840確實是slg1突變體的致病基因。

SLG1編碼一個保守的細胞質tRNA 2-硫化蛋白2（RCTU2），它的功能缺陷會導致水稻體內的tRNA硫醇化水平缺陷，並伴隨明顯的高溫敏感表型；而過表達SLG1則可顯著提高水稻對高溫耐受性。slg1是高度熱敏性的，約45％的突變幼苗在45°C處理44 h後死亡，而恢複後90％以上的WT存活（圖1e）；同樣，高溫處理後SLG1-RNAi植物的存活率也顯著降低（圖1f和圖1f）。相反，在相同的脅迫條件下，SLG1-OE幼苗的存活率（> 90％）比野生型（≈60％）要高得多（圖1g），SLG1-OE粒長和植物構型與野生型相似（圖1a，b）。綜上所述，這些結果表明SLG1在水稻耐熱性中發揮正調控作用。

在酵母中，CTU2似乎通過與CTU1形成功能複合物而催化tRNA硫醇化過程的最後一步。在水稻中鑒定出LOC_Os02g52470和LOC_Os01g41565的兩種同源蛋白。LOC_Os02g52470與ROL5 / AtCTU1具有很高的序列相似性，因此標注為水稻CTU1蛋白（RCTU1）。為了研究RCTU1是否與SLG1在相同的作用途徑，分別在WT（SLG1RCTU1-RNAi）和slg1（slg1RCTU1-RNAi）背景下構建了RCTU1-RNAi轉基因植物，發現SLG1RCTU1-RNAi和slg1RCTU1-RNAi轉基因植物均表現出與slg1類似的表型，包括增加的籽粒長度，細長的植物結構和有缺陷的根系。此外，類似於SLG1，RCTU1的轉錄也被高溫高度誘導（圖1d），並且SLG1RCTU1-RNAi和slg1RCTU1-RNAi幼苗的存活率在高溫下均大大降低（圖1h）。這些結果表明，RCTU1-SLG1複合物在水稻耐熱性中起重要作用。

圖1 | SLG1在水稻耐熱性中發揮正調控作用

（a，b） slg1，WT和slg1-C，SLG1-RNAi和SLG1-OE的T2轉基因植株表型和粒形；

（c）SLG1基因的精細定位；

（d）SLG1和RCTU1在高溫誘導下的表達；

（e–g） SLG1是耐熱性的正調控因子；

（h） RCTU1-RNAi顯示出與slg1突變體相似的表型；

2、SLG1介導的耐熱性與硫醇化tRNA水平呈正相關

CTU1–CTU2複合物負責胞質tRNA的2-硫醇化，硫醇化的損失導致了酵母菌株中的熱敏表型的喪失。本研究發現slg1中的硫醇化tRNA數量遠低於WT，這表明SLG1的功能喪失會破壞突變體中的tRNA硫醇化。SLG1的功能異常會影響tKUUU，tEUUC和tQUUG的硫醇化水平（圖2b）。

通過比較正常和高溫條件下的硫醇化tRNA水平來分析高溫對tRNA硫醇化的影響。升溫影響水稻中U34的硫醇化並導致tRNA的低硫醇化（圖2c）。在高溫下，WT中的tRNA硫醇化水平比slg1高得多（圖2d），這與WT的較高存活率相符（圖1e）。隨著WT，SLG1RCTU1 RNAi，slg1和slg1RCTU1-RNAi中tRNA硫醇化水平的降低（圖2e），植物的存活率分別降低至90％，36.5％，15.2％和5％（圖2e）。相反，與WT相比，具有更高tRNA硫醇化水平的SLG1-OE植物具有更高的耐熱性（圖1g，2f）。綜上所述，SLG1介導的耐熱性與tRNA硫醇化水平呈正相關。

圖2 | SLG1介導的耐熱性與tRNA硫醇化水平呈正相關

（a）slg1和WT之間tRNA硫醇化水平的比較；

（b） Northern印跡分析，使用tKUUU，tEUUC和tQUUG的3種tRNA異構體來檢測特異的硫醇化tRNA；

（c） tRNA硫醇化過程受到高溫脅迫的不利影響。NC，正常情況；HC，高溫（45°C，44 h; g）條件下。

（d–f） tRNA硫醇化水平的比較；

此外，本文運用iTRAQ蛋白質組學
探索了tRNA硫醇化對蛋白質的影響，鑒定到1610個蛋白，其中112個為差異蛋白（FC1.2）。發現SLG1的功能障礙會影響蛋白質的積累，尤其是涉及翻譯，代謝和應激反應的蛋白質的積累
。蛋白質組學分析
也揭示了slg1突變體中五種蛋白質（TrEMBL UniProt ID：Q6ZFJ9，Q651B0，Q653F6，Q6Z2M2和Q9LWT6）的積累，這些蛋白質與unfolded protein binding and chaperone-mediated protein folding有關。此外，發現該突變體中異常合成了一些氧化應激相關蛋白，例如TrEMBL UniProt ID Q0E4K1，Q0DTX5，P93407和Q6L4W7，這可能是由於未折疊的蛋白應答與活性氧（ROS）信號。因此，植物中的tRNA硫醇化狀態似乎與ROS穩態密切相關，這可能對攜帶SLG1Ind的植物耐受高溫脅迫有利。

3. SLG1的分化分析

使用4219個水稻種質進一步分析了SLG1的自然變異，並在SLG1的啟動子和編碼區分別發現了10個和7個SNP（圖3a）。在編碼區的七個SNP中，T865C和G1839T的兩個核苷酸取代分別引起氨基酸從Val177到Ala177的轉化以及從Val362到Phe362的氨基酸轉化，而其他五個是同義取代（圖3a）。

在栽培稻中發現了兩個氨基酸突變，其中9稻中有Val8.2-Val362的9稻占98.2％，粳稻中Ala177-Phe362的粳稻占99.1％，表明它們對SLG1的功能分化有貢獻。基於多態性，可將4219個種質分為5個單倍型（圖3b），其中767個（96.1％）溫帶粳稻種中的737攜帶Hap1，而2691個（93.9％）in稻種中的2527個攜帶Hap2。值得注意的是，幾乎所有的aus種質（98.9％）都可以明確地分類為Hap4。熱帶粳稻（Trj）組有兩個主要的單倍型，Hap3（73.9％）和Hap1（25.5％），它們在啟動子區域中只有一個核苷酸（A252C）不同。Hap5僅在the蟲組中以極低的頻率（約0.8％）發現，與Hap2高度相似，除了啟動子區域的單個核苷酸差異（G432A）。

除了野生稻種之間SLG1基因組區域的大量變異外，野生稻種中SLG1單倍型的數量與Ind，Tej，Trj和Aus的完全相同。例如，in稻品種93-11的SLG1等位基因與野生稻登錄號W1687（Hap2）相同；澳洲品種Kasalath與W593（Hap4）具有相同的單倍型；溫帶粳稻品種Nipponbare攜帶與W3078（Hap1）相同的SLG1等位基因，而熱帶粳稻品種NERICA3與W120（Hap3）具有相同的等位基因。這些結果表明，SLG1Tej，SLG1Trj，SLG1Ind和SLG1Aus可能代表了保存在不同麥冬野生稻種中的古老等位基因，並且可能在水稻馴化的早期進行了陽性選擇。

圖3 | SLG1在亞洲栽培稻中的分化

（a）對來自4219個亞洲栽培稻種的SLG1啟動子和編碼區的單倍型分析；

（b）五種SLG1單倍型在亞洲不同栽培稻品種中的分布頻率。

4. SLG1Ind表現出很強的耐熱性

推測SLG1差異可能是兩個亞種（indica和japonica）耐受不同環境溫度的決定性因素。通過將SLG1（SLG1Ind）的等位基因引入KY131（SLG1Tej）來構建近等基因系（NIL）（圖4a）。在正常生長條件下，獲得的NIL-SLG1Ind和NIL-SLG1Tej植物在苗期表現出與其相應受體相同的外觀（圖4b）。當遇到高溫脅迫時，NILSLG1Tej幼苗的存活率（50％）要比indica受體ZF802的存活率（93％）低得多（圖4b）。相反，NIL-SLG1Ind幼苗的耐熱性相對於KY131顯著提高，NIL-SLG1Ind的平均成活率約為81％，而KY131的平均成活率約為48％（圖4b），表明SLG1Ind優於SLG1Tej在植物中耐受高溫脅迫。

圖4 | SLG1Ind比SLG1Tej具有更高的耐熱性

（a）NIL-SLG1Ind和NIL-SLG1Tej的染色體圖。紅色矩形表示包含SLG1基因座的供體片段。NIL-SLG1Ind表示帶有來自ZF802（indica）的SLG1Ind等位基因的KY131（溫帶粳稻），NIL-SLG1Tej表示帶有來自KY131的SLG1Tej等位基因的ZF802；

（b）SLG1Ind和SLG1Tej等位基因之間的耐熱性比較；

為了進一步評估SLG1Ind和SLG1Tej之間的功能差異，通過轉基因方法擴增了KY131和93-11中SLG1的啟動子和基因序列，並將它們引入slg1中以生成互補植物JPJC（帶有Tej-的Tej型啟動子）。IPIC（具有Ind型基因序列的Ind型啟動子）品系顯示出比JPJC更高的耐熱性，在IPIC中的平均存活率約為69％，而在JPJC中約為29％（圖5a，b）。

為了了解tRNA硫醇化在SLG1Ind和SLG1Tej的耐熱性差異中的作用，對IPIC和JPJC植物中的硫醇化tRNA進行了定量分析。slg1中的tRNA硫醇化水平比野生型顯著降低（圖5c），並且SLG1Ind或SLG1Tej的引入挽救了突變體的硫醇化缺陷（圖5c）。這些結果表明SLG1介導的tRNA硫醇化是SLG1Ind和SLG1Tej之間耐熱性差異的原因。

圖5 | SLG1Ind互補植物顯示出很強的耐熱性和高tRNA硫醇化水平

（a，b） IPIC，IPJC，JPIC和JPJC之間的耐熱性比較；

（c，d）基於LC/MS-QQQ（c）和APM（d）方法檢測slg1，WT，IPIC和JPJC轉基因品系中的tRNA硫醇化水平；

5. SLG1Ind可提高水稻孕穗期的耐熱性

水稻植物對高溫脅迫高度敏感，尤其是在孕穗期，因此提高生殖階段的耐熱性對於減少產量損失尤為重要。對成年植物slg1和WT進行了高溫處理，以評估SLG1在孕穗期的作用。發現slg1的結實率低於28％，而WT的結實率在40°C處理5天後可達到72％（圖6a，b）。這些結果表明，SLG1在生殖階段的耐熱性中起重要作用。

在我們的NIL品系中，我們觀察到NILSLG1Ind植物的育性降低，這很可能是由於SLG1與雜種不育基因HSA145的緊密聯系所致。為了進一步探討SLG1在生殖階段的可能作用，我們從IPIC，IPJC，JPIC和JPJC構建體中分別選擇了8條獨立系，其中一半經高溫處理5天，另一半經7天處理。IPIC顯示出最高的結實率，在高溫處理5天和7天後分別達到約81％和49％（圖6c，d）；相反，JPJC的結實率分別僅為約47％和22％（圖6c，d）。處理5天和7天後IPJC系的結實率分別約為68％和43％，而JPIC系的結實率分別約為63％和37％（圖6c，d）。這些結果進一步表明，SLG1Ind的啟動子和編碼序列上的變異都有助於水稻的耐熱性。

圖6 | SLG1Ind可以提高孕穗期的耐熱性

（a，b）slg1突變體在孕穗期對高溫高度敏感；

（c，d） IPIC，IPJC，JPIC和JPJC之間的耐熱性比較；

研究結論

SLG1編碼一個保守的細胞質tRNA 2-硫化蛋白2 (RCTU2)，它的功能缺陷會導致水稻體內的tRNA硫醇化水平缺陷，伴隨著明顯的高溫敏感表型；而過表達SLG1則能夠顯著提高水稻對高溫耐受性。通過對栽培稻序列分析發現，SLG1在品種中存在單倍型分化，其中96.1%的溫帶粳稻屬於一種單倍型，而93.9%的秈稻則屬於另外一種單倍型，暗示SLG1可能是一秈粳稻分化基因，核酸序列多態性分析也表明SLG1是一個顯著的馴化選擇位點。攜帶秈型SLG1的水稻植株對孕穗期高溫也具有更強的抵抗能力。

圖7 | 馴化期間SLG1等位基因的選擇模型

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SLG1能夠與水稻中細胞質tRNA 2-硫化蛋白1（RCTU1）互作，RCTU1功能缺陷也導致水稻tRNA硫醇化水平降低和高溫敏感表型。水稻的高溫耐受性和tRNA硫醇化水平呈正相關。通過對4219個栽培稻序列分析發現，SLG1在品種中存在單倍型分化，其中96.1%的溫帶粳稻屬於一種單倍型，而93.9%的秈稻屬於另一種單倍型，暗示SLG1可能是一秈粳稻分化基因，核酸序列多態性分析也表明SLG1是一個顯著的馴化選擇位點。通過對近等基因系及轉基因植株的高溫處理試驗表明，攜帶秈型SLG1的水稻植株比攜帶粳型SLG1水稻植株具有更強的高溫耐受能力，且與tRNA硫醇化水平呈正相關。通過啟動子和編碼區互換不同轉基因材料熱處理實驗顯示，SLG1啟動子區和編碼區的序列差異共同決定秈型和粳型SLG1耐熱性差異。同時，攜帶秈型SLG1的水稻植株對孕穗期高溫也有更強的抵抗能力。因此，該研究證明tRNA硫醇化修飾在水稻響應高溫脅迫中的重要功能，並為應對全球變暖、設計培育高溫脅迫耐受性水稻品種提供有效策略。

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參考文獻：

Xu Y, Zhang L, Ou S, Wang R, Wang Y, Chu C, Yao S. Natural variations of SLG1 confer high-temperature tolerance in indica rice. Nat Commun. 2020 Oct 28;11(1):5441. doi: 10.1038/s41467-020-19320-9. PMID: 33116138.

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