打破“內卷”循環，後核酸組學時代的單細胞蛋白組學

鹿明生物

編者按：

早在今年3月，HUPO國際大會
——全球蛋白質組領域的盛會，也是蛋白質組領域最高規格的學術大會。就以“從單細胞到系統生物學的蛋白質組學在健康和疾病中的應用”為主題，共設有14個主題分壇。
探討“單細胞蛋白質組學”最新前沿技術突破及在未來應用價值。

在這篇科普文章中，作者將簡要介紹目前單細胞蛋白組學的進展以及應用。通過不懈的探索與改進，相信揭示生命科學普適規律的單細胞蛋白組學之“夢”並非遙不可及。

前言

隨著二代測序技術的持續發展，單細胞基因組和轉錄組研究突飛猛進，使學者們對細胞認識的分辨率大大提高。然而僅依靠單細胞的基因組和轉錄組數據，對理解細胞在人體複雜環境中的表型和功能還遠遠不夠。蛋白質作為細胞內生物功能的直接執行者，通過蛋白質及其翻譯後修飾的動態變化，可以感知並響應外在和內在的刺激，從而影響整個生命體的功能和狀態。因此單細胞蛋白質組受到研究者們越來越廣泛的關注，是目前及未來重點研究的熱點之一。

本文為2021年美國東北大學的Nikolai Slavov
教授團隊在Genome Biology
期刊上發表了題為“Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2
”的研究論文。該研究采用Minimal ProteOmic sample Preparation (mPOP)樣本處理
和TMT標記方法
，優化了單細胞蛋白質組
（SCoPE-MS)的實驗流程，進而對單個哺乳動物細胞進行質譜分析，量化細胞分化過程中的單細胞蛋白質豐度和異質性。研究中SCoPE2可以在10天的儀器時間內對1490個單核細胞和巨噬細胞中的3042種蛋白質進行定量，這些定量的蛋白質使我們能夠按細胞類型區分單細胞。

中文標題：
單細胞的蛋白組和轉錄組聯合解析巨噬細胞的異質性

英文標題:
Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity

期刊名稱:
Genome Biology

影響因子:
10.806

技術策略:
單細胞蛋白質組學

研究背景

細胞是生命體的最小組成單位，遺傳及外部環境等因素使單個細胞異質性廣泛存在於眾多生物體中，而組織和器官由功能特化的細胞組成，單細胞的這種特化通常源於介導生理功能的蛋白質網絡。然而，目前在單細胞中全面量化構成這些網絡的蛋白質的能力仍然相對有限。因此，單細胞中的蛋白質水平通常是從間接替代品中推斷出來的——從它們相應的 mRNA 中讀取序列。

現有的單細胞 RNA 測序方法中 scRNA-seq 協議捕獲了細胞中大約 10-20% 的分子，因此對於許多轉錄本而言，所得到的樣本非常稀少，並且許多轉錄本以低拷貝數存在。因此，對 mRNA 豐度的估計明顯受到采樣（計數）誤差的影響。而大多數蛋白質在每個細胞中的拷貝數是其相應轉錄本的 1000 多倍。因此，蛋白質的高拷貝數可能允許在沒有擴增的情況下對其進行定量。然而，大多數用於定量單細胞蛋白質的技術都依賴於抗體，其特異性有限。盡管串聯質譜 (MS/MS) 與液相色譜 (LC) 和電噴霧電離 (ESI) 相結合，已經能夠對大量樣品中的蛋白質進行准確、高特異性和高通量的定量，但其在單細胞中的應用處於起步階段。

為了將這些強大的 MS 技術應用於單細胞分析，該團隊開發了質譜法單細胞蛋白質組學
。
該方法引入了等壓載體的概念，它具有三個重要作用：(i) 減少樣品損失；(ii) 在MS1 調查掃描期間增強離子的可檢測性；(iii) 為肽序列鑒定提供碎片離子。通過將這一概念與 MS 兼容的細胞裂解相結合，作者確定了應用多重 LC-ESI-MS/MS 來量化單個細胞蛋白質的可行性。

該研究徹底檢查了多個實驗步驟，包括細胞分離、裂解和樣品制備。此外，該實驗優化 MS 數據采集的方法（DO-MS；數據驅動的 MS 優化）以及在獲得後解釋這些數據。例如，用於增強肽識別的DART-ID技術（數據驅動的保留時間對齊）。將這些進步與SCoPE2 相結合，顯著提高了定量和通量。

實驗流程

SCoPE2的總體工作流程如下圖所示。單個細胞被分離在單獨的孔中，進行裂解，並將其蛋白質消化成肽。來自每個單個細胞的肽串聯質譜標簽(TMT)共價標記，因此，具有相同序列(和質量)的標記肽在MS1掃描中顯示為相同m/z的峰，質譜儀器會將這些峰分離並將其進一步碎裂。除了產生有助於肽段鑒定的片段外，碎片還產生報告離子(RI)，其豐度反映相應樣本(單細胞)中的蛋白質豐度。

圖1 | SCoPE2技術的單細胞捕獲和工作流程

裂解物中的蛋白質用胰蛋白酶消化；所得肽經TMT標記後用LC-MS/MS分析。SCoPE2集包含參考通道。以DO-MS優化LC-MS/MS分析，用DART-ID來加強對肽段的鑒定。

實驗結果

SCoPE2相對於SCOPE-MS的主要進展

■ 一、自動化和微型化細胞裂解

SCoPE2通過最少的蛋白質樣品制備（mPOP）裂解細胞。mPOP使用冷凍-加熱循環，可在純水中有效地提取蛋白質，從而避免了MS分析之前的樣本損失。mPOP允許在多孔板中制備樣品，從而可以與PCR熱循環儀和液體分配器並行處理多個樣品。這種對SCoPE-MS的改進使SCoPE2能夠將裂解體積減少10倍，從10μl減少到1μl，將耗材和設備的成本降低100倍以上，並通過並行處理將樣品制備的通量提高100倍以上。

■ 二、提高通量並改善定量

SCoPE2引入了更短的nLC梯度，這允許每單位時間分析更多細胞。此外，采用了更窄的分離窗口（0.7 Th）來改善離子分離，從而改善了定量。

■ 三、系統參數優化

利用他們同時開發的DO-MS軟件基於質譜法的數據進行參數優化。

■ 四、增強的肽段序列鑒定

通過他們組之前開發的DART-ID去做蛋白肽段的鑒定的優化，能更加准確的知道每條肽段所對應的蛋白。

SCoPE2用於細胞分群

接下來作者開始進行單細胞蛋白組學分析測試：制作100xM的standard樣本，其中分為5000細胞的對照和100的單細胞組（圖2b），測試使用1xM樣本，發現50細胞左右的蛋白比與單個細胞的蛋白比的相關性為0.84（圖2c），並且能做到很好的一致性（50個細胞和單細胞）與分群（不同類型細胞）（圖2d）。

圖2 | 單細胞蛋白質組學分析測試

在確認單細胞流程可用後，作者將其應用到細胞分化中：

在觀察到數據質量和結果良好後，作者將流程用於細胞分群：

作者通過分析單核細胞和巨噬細胞大量樣本所確定的差異顯著的蛋白質豐度的中位數對每個細胞進行了顏色編碼。得到的結果與它們的細胞類型一致，從而支持了SCoPE2數據可用於對細胞類型進行分類。

測試表明，SCoPE2流程可用於細胞類型的分類。

結論

核心技術：單細胞蛋白質組學質譜技術
（Single-Cell ProtEomics by Mass Spectrometry，SCoPE-MS）：在蛋白組學技術中引入等壓載體概念，實現高通量、低成本蛋白質組學測定。本研究中研究人員進一步對多個實驗步驟進行了改進形成SCoPE2，並開發了MS數據獲取的優化方案（DO–MS; Data-driven Optimization of MS）、數據解讀方案（(DART-ID; Data-driven Alignment of Retention Times for IDentification），從而提高檢測通量和定量准確性、改善不同單細胞之間的數據整合、促進肽段序列鑒定。

同時，作者能夠描述骨髓細胞分化過程中出現的異質性，並探索調控相互作用。所描述的方法學是通用的，可廣泛應用於推動描述性單細胞研究向分子機制的定量探索方向發展。

Specht, H., et al. Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2. Genome Biol 22, 50 (2021).

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