高精度單鹼基基因編輯工具研究獲進展

中科院之聲CRISPR/Cas9的衍生工具DNA單鹼基編輯技術可以在不切斷DNA雙鏈的情況下實現單核苷酸的定向突變，為單鹼基突變引起的遺傳性疾病的治療帶來了希望，自2016年首次報導以來受到了廣泛的關注。2019年，單鹼基編輯工具的安全性受到了質疑，先是楊輝等研究組報導了胞嘧啶單鹼基編輯器存在嚴重的DNA脫靶，接著Keith Joung團隊、David

Liu團隊和楊輝團隊又分別報導了胞嘧啶單鹼基編輯器和腺嘌呤單鹼基編輯器存在大量的RNA脫靶效應。雖然先前的研究中通過引入突變的方式顯著降低了RNA的脫靶，但是胞嘧啶單鹼基編輯器的DNA脫靶依然沒有得到解決。

5月18日，Nature Methods期刊在線發表了題為A rationally engineered cytosine base editor retains high on-target activity while reducing both DNA and RNA off-target

effects的研究論文，該研究由中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心（神經科學研究所）楊輝研究組、中國科學院上海營養與健康研究所隸屬的計算生物學研究所（中國科學院-馬普學會計算生物學研究所）李亦學研究組和中國農業科學院深圳農業基因組研究所左二偉研究組合作完成。該研究根據蛋白結構預測了脫氨酶ssDNA結合的重要胺基酸，在不影響催化活性的情況下，突變相應的胺基酸（APOBEC1上的ssDNA結構域相應胺基酸），從而得到了顯著降低DNA脫靶的CBE突變體。

CBE的脫靶是由脫氨酶產生的。脫氨酶利用自身的ssDNA和RNA結合能力，攜帶Cas9蛋白在基因組或者轉錄組中隨機與ssDNA和RNA結合，並且利用自身催化活性將C突變為T，從而造成單鹼基基因編輯工具基因組和轉錄組範圍內完全隨機無法預測的脫靶效應。對此，研究者通過兩種方式試圖降低CBE的脫靶，第一種是在CBE的脫氨酶APOBEC1上引入突變，以此消除ssDNA和RNA的結合能力。他們一共構建了23個CBE突變體，其中4個突變體不影響基因編輯效率檢測，而後通過DNA和RNA的脫靶檢測後獲得的3個突變體BE3R126E、BE3R132E和YE1-BE3能夠顯著降低DNA和RNA的脫靶SNV。該方法是通過突變APOBEC1上的核酸結合域關鍵位點，改變蛋白構象，破壞結合能力，降低隨機脫靶。另外一種方式是利用來自於人的APOBEC3A蛋白替換APOBEC1蛋白，並在APOBEC3A的ssDNA結合位點引入突變，但是這種方式只能降低RNA的脫靶，而不能降低DNA上的脫靶。因此，該研究以YE1-BE3為研究重點。為進一步提高YE1-BE3編輯效率，研究者隨後又在突變體基礎上增加標籤和核定位序列（FNLS）。優化後的單鹼基編輯工具YE1-BE3-FNLS在保證高保真的情況下，顯著提高了基因編輯效率，從而成新型基因編輯工具。

該研究結果和David Liu團隊今年2月10日發表在Nature Biotechnology的研究結論一致，兩篇文章都報導YE1在保持較高的編輯效率的同時降低了DNA和RNA上的脫靶，同時縮小了編輯窗口，並降低了indel產生的比例。但是David

Liu團隊基於細菌抗性篩選的方法只適用於CBE，而楊輝團隊基於GOTI的方法是不受限制的，不僅可以檢測單鹼基編輯器，還可以用於其它基於融合蛋白的基因編輯工具的安全性檢測和改進。在本研究中楊輝團隊使用GOTI和RNA-Seq同時檢測了突變體的DNA脫靶和RNA脫靶，並且發現DNA和RNA的脫靶是互相獨立的，需要同時檢測。他們獲得的

YE1-BE3-FNLS是高精度、高活性單鹼基編輯工具，顯著降低了脫靶效應，提高了編輯效率，有望應用於遺傳疾病基因治療，推動基因編輯臨床化應用。

中國農業科學院深圳農業基因組研究所研究員左二偉，中科院分子細胞卓越創新中心博士孫怡迪，中國農業科學院深圳農業基因組研究所助理研究員袁堂龍，中科院腦科學與智能技術卓越創新中心博士賀冰冰和周昌陽為論文共同第一作者，楊輝、李亦學和左二偉為共同通訊作者。