Orbitrap超高分辨率質譜輔助揭開Z基因組生物合成通路的面紗

賽默飛色譜與質譜中國

關注我們，更多幹貨和驚喜好禮

史碧雲

天津大學張雁教授聯合上海科技大學趙素文教授、美國伊利諾伊大學Huimin Zhao教授等研究團隊，在生命科學領域取得突破性研究成果：解析了一種特殊DNA的合成機制，並發現了這種特殊DNA遍布全球，大量能感染細菌的病毒（這種病毒也稱為噬菌體）都含有這種DNA。

這項重大發現對生命起源、物種進化、系統生物學的研究具有重要理論意義。該成果潛在應用價值廣闊，包括超級耐藥菌感染的治療、綠色無抗生素畜牧飼料和食品保存技術開發、新型納米材料制備、DNA信息存貯等。論文於4月30日在國際頂級學術期刊《科學》刊發。天津大學為本項研究成果的第一完成單位。

人類對於生命奧秘的探索從未停止，而基因作為生命的遺傳物質自然而然地吸引了很多的研究者。1953年，Waston和Crick教授發現了脫氧核糖核酸（DNA）的雙螺旋結構，開啟了分子生物學時代，使得人類對於生命的研究到了分子水平，解開了一個又一個生命的奧秘。二位教授也和Wilkins教授一起獲得了1962年的諾貝爾生理學和醫學獎，以表彰他們在DNA雙螺旋結構研究中的突出貢獻。

DNA有各種不同形式的修飾，其功能也不盡相同，但是通常情況下其堿基配對方式不會改變，即腺嘌呤（Adenine，A）和胸腺嘧啶（Thymine，T）配對，而鳥嘌呤（Guanine，G）與胞嘧啶（Cytosine，C）配對。

然而1977年前蘇聯科學家研究發現<1>藍藻噬菌體S-2L為Z基因組生物（DNA中只含有Z、G、C、T），其遺傳物質DNA中的腺嘌呤（A）完全被二氨基嘌呤（Diaminopurine，Z）取代，Z與T（胸腺嘧啶）堿基配對形成了三個氫鍵，從而改變了DNA的各種物理、化學性質，其堿基配對方式如下圖所示。噬菌體Z基因組的生物通路研究具有重大理論意義。此外，Z堿基已在碳質隕石中被檢測到，提示它可能是參與生命起源的核堿基<2>。

藍藻噬菌體S-2L的基因組編碼一個合成酶PurZ，PurZ為腺苷琥珀酸合成酶（PurA）的同源蛋白。在許多生物體中，PurA和PurB（腺苷琥珀酸裂解酶）通過兩步酶促反應將單磷酸肌苷（Inosine monophosphate，IMP）轉換為單磷酸腺苷（Adenosine monophosphate， AMP），如下圖所示，有研究表明PurZ參與了噬菌體Z-genome的生物合成<3>。

為研究Z基因組的生物合成，上海科技大學的趙素文研究員、天津大學的張雁教授和美國UIUC的趙惠民教授課題組對參與Z基因組合成的複合酶進行了研究，並利用紫外-可見光譜和液相色譜-Orbitrap超高分辨率質譜聯用技術對噬菌體PurZ的生物活性進行了檢測分析。

首先，對噬藍藻體S-2L（Cyanophage S-2L）的PurZ（CpPurZ）及與其同源性最高的菌株中華杆菌（Sinbacteraceae）噬菌體PurZ（SbPurZ）進行重組表達純化，並將這兩種PurZ複合酶的活性位點同Escherichia coli PurA複合酶（EcPurA）進行比較。

EcPurA的底物為IMP、三磷酸鳥苷（Guanosine triphosphate，GTP）和天冬氨酸（Aspartate，Asp），它可催化GTP的末端磷酸轉移至IMP，然後用Asp取代這個磷酸，催化生成腺苷琥珀酸（Adenylsuccinate）<4>，如下圖所示：

在PurA複合酶的GDxxKG基序（其中x為任意氨基酸）中，其催化殘基Asp13在PurZ中被Ser殘基取代，這兩個酶的分子模型如下圖所示，由圖可清晰地了解到，用體積較小的Ser取代Asp後，PurZ活性口袋就有足夠的空間容納底物（dGMP）中的2號位的氨基，PurZ的底物是脫氧磷酸鳥苷（dGMP），三磷酸腺苷（ATP）和天冬氨酸（Asp）。PurZ酶的催化機理如下圖：

為了檢測PurZ的催化活性，研究者將PurZ與過量的底物dGMP、ATP和Asp孵育，並檢測不同時間點的吸收光譜，對堿基的反應程度進行監測。結果可見，隨著時間的增加，紫外-可見光譜在287nm處有明顯吸收，表明2-氨基脫氧腺苷琥珀酸（2-aminodeoxyadenylosuccinate）的生成。

為進一步確定PurZ催化反應的中間體及產物，研究者使用UltiMate3000 RSLCnano液相色譜-Q Exactive HF Orbitrap超高分辨質譜聯用對反應樣品進行了檢測，結果顯示，相比沒有加SbPurZ的樣品，加入SbPurZ進行反應後可多檢測出兩個質譜峰，同標准品進行比對，其精確質荷比表明這兩個產物分別為二磷酸腺苷（Adenine 5′-diphosphate，ADP）和2-氨基脫氧腺苷琥珀酸（2-Aminodeoxyadenylosuccinate，ADAS），其中ADAS的碎片離子峰如下圖）。

噬藍藻體S-2L沒有編碼PurB裂解酶，宿主的PurB可能參與了將ADAS轉化為dZMP，將SbPurZ的反應產物與EcPurB一起孵育，結果顯示ADAS的質譜峰消失，同時出現一個質荷比為345.0718的質譜峰，其一級和二級質譜圖如下（可左右劃動查看所有圖片），經鑒定得知此峰為dZMP，實驗結果表明宿主細菌的PurB複合酶參與了dZMP的生成。

參考文獻：

<1> Kirnos, M. D., et al. "2-Aminoadenine is an adenine substituting for a base in S-2L cyanophage DNA." Nature 270.5635 (1977): 369-370.

<2> Callahan, Michael P., et al. "Carbonaceous meteorites contain a wide range of extraterrestrial nucleobases." Proceedings of the National Academy of Sciences 108.34 (2011): 13995-13998.

<3> Zhou, Yan, et al. "A widespread pathway for substitution of adenine by diaminopurine in phage genomes." Science 372.6541 (2021): 512-516.

<4> Honzatko, Richard B., et al. “Structure±Function Studies of Adenylosuccinate Synthetase from Escherichia coli.” Archives of Biochemistry and Biophysics 370.1 (1999): 1-8.

如需合作轉載本文，請文末留言。